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     降鈣素基因相關肽（CGRP）是一種廣泛表達的神經肽，在感覺神經傳遞中起重要作用。CGRP受體是降鈣素受體樣受體（CLR）B類蛋白偶聯受體和1型跨膜結構域蛋白受體M的異源二聚體。可溶蛋白1（RAMP1）。在此，我們報道了人CGRP受體復合物與CGRP和GS蛋白等三聚體的結構。該結構通過低溫電子顯微鏡測定，具有3.3的全局分辨率，受體修飾蛋白的跨膜結構域位于CLR跨膜區3, 4和5之間的界面上，并穩定CLR的胞外環2。僅與CGRP直接接觸，這與CLR變構調節中的功能一致。分子動力學模擬表明RAMP1為受體復合物提供了穩定性，特別是在CLR胞外域的定位中。控制G蛋白偶聯受體的功能。
    
     所有相關數據可從作者處獲得，或包含在手稿或補充信息中。原子坐標和冷凍-電磁密度圖已存儲在編號6e3y的蛋白質數據庫和帶有條目EMD-8978的電子顯微鏡數據庫中。
    
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     這項工作得到了莫納什大學拉馬喬蒂低溫電子顯微鏡中心、澳大利亞衛生與醫學研究委員會(NHMRC)項目(1120919)和NHMRC項目(1055134)的資助。戴德華是NHMRC職業發展研究員，陳凱是NHMRCJ馬丁公司的研究員。詹姆斯·庫克研究員是馬斯登基金會的研究員，這兩人都是新西蘭皇家學會資助的。中華民國是皇家學會會員，感謝BBSRC（BB/M06833/ 1）的支持。烏洛斯和朱麗塔為其分析和技術支持，古德拉特為來自活動CTR的CLR初步同源建模，弗內斯、趙平和高爾為其有益的討論。
    
     友一公司從事病毒生產、昆蟲細胞表達、純化、負染電子顯微鏡、數據收集和分析、冷凍電子顯微鏡樣品的制備，負責模型的建立和改進，并協助手稿的制備。進行冷凍樣品制備、相板成像、數據采集、電鏡數據處理與分析，計算冷凍EM圖，輔助原稿制作。博士生分子動力學模擬，協助原稿制作。科技部協助建立和改進模型，審稿，根據細胞分析和數據分析，審稿，對MRI手稿進行了初步分析。約翰遜博士和世界銀行組織并管理了電壓階段開發項目。博士提供對CGRP受體的洞察力，協助數據解釋和手稿審閱。摩根士丹利提供對B類GPCR的洞察力，協助數據i解讀和審查手稿。在數據解釋和手稿準備方面交換協助。中央情報局設計了分子動力學模擬以協助數據解釋和幫助撰寫手稿。鄧文迪負責總體項目戰略和管理、數據。分析和解釋并協助撰寫手稿。下午3點，負責總體戰略和管理，數據解釋和手稿寫作。
    
     對這些序列進行注釋以指示血凝素（HA）信號序列（紅色高亮）、3C切割位點（灰色高亮）、標記（深橄欖綠色高亮）和希斯標記（紫色高亮）的位置。CLR和ram P1的跨膜螺旋結構域以綠色框架顯示并突出顯示。EM圖譜中未分析的蛋白片段以黃色突出顯示。側鏈密度有限但主鏈密度有限的氨基酸S在模型中被剔除，在序列中顯示為紅色。
    
     A.未標記CLR-ram P1(野生型(WT)CLR-ram P1)和純化的構建(HA-Flag-CLR and Flag-ram P1)的藥理學，CGRP介導的cAMP在瞬時轉染的COS-7細胞中的積累。N=5個獨立實驗，重復3次；數據均值+標準偏差B，表達和純化。策略：從色譜洗脫曲線中排除C和絡合物的最終尺寸。D、SDS—PAGE和考馬斯藍染色顯示絡合物中各組分的存在。
    
     伏相板復合體的顯微照片（代表3180膠片）。高對比度的相板成像有助于穩健的顆粒選擇，雖然顆粒是低聚焦和緊密堆積的。B，重新發布2D類平均結果。C，映射細化工作流程。d銳化，計算RELION.E，金標準傅立葉殼相關曲線，總標稱分辨率為3.26.F。過擬合通過將所有原子隨機移動到0.5來評估，并根據低溫EM半圖進行細化。在得到的模型和用于稀釋的半圖（綠色）、生成的模型和用于交叉驗證的另一半圖（紅色）、以及最終的稀釋模型和完整的圖（藍色）G之間，urve與CLR的TM4和TM2堿基的潛在脂質相互作用。
    
     顯示受體、CGRP肽(不包括map中未解析的lyp24-Asn25-Asn26序列)、斜坡跨膜結構域和冷凍-EM密度圖，以及所有7個跨膜螺旋和每個斜坡ECD螺旋的H8的模型。采用PDB中R1 ECD的剛體擬合模型:4rw G12,還顯示Gαs-Ras結構域的N-末端(αH1)和C-末端(αH5)α螺旋,上標P表示降鈣素基因相關肽的殘留。
    
     研究了CLR(藍帶)和ram P1(橙帶)的ECD骨架以及用X射線晶體學12(淺灰帶)求解的分離的CLR-ram P1 ECD復合物的結構，在ram P1 ECD上對準了結構，對CLR環(環1-5)進行了注釋，得到了CLR環1和環的序列。5在低溫EM圖中未被解析，用黑點箭頭表示，CLR環4和5的主鏈位置的差異用藍色（活性復合物）和灰色（孤立ECD復合物）點箭頭表示，CGRP肽的位置用深紅色表示。
    
     CLR-CGRP-ram P1-Galphaβ-Nb35(黑色，2.4us)、CLR-CGRP-ram P1-Galpha(371-394)紫色，2us)和CLL-CGRP-Galpha(371-394，藍色，2us)的模擬。C和CGRP(疊加在T6 S17上)對半數N個端子有效。一般來說，冰凍-電磁密度圖中缺失的片段對應RMSF高的區域，ECD整體擬合的難度是交流電。ECD(D55ECD-V63ECD)和Q107ECD-g109 ECD的缺失片段對應于最遠離跨膜區的外環區。D55ECD-V63ECD顯示更大主干RMSF為8，而Q107ECD-g109 ECD顯示同樣高的RMSF為7.5。A79 ECD-g81 ECD和p115 ECD-s117 ECD附近的RMSF亞峰值稍低，但在跨膜區仍可分辨(a)ICL3(h324 ICL3-s328 ICL3)和EC。L3（p356 ec3-e362 EC3）都含有缺失的殘基，與RMSF高于4.5（B）。雖然CGRP與近端相互作用（無缺）區EC3，在這個區域有沒有持續的相互作用的分子動力學模擬中，ICL的RMSF值（3.6）和ICL二（3）ARE高，造成茬（k1672.40）和e248 ICL ICL 2），但2 250骨架被分解，CGRP，26殘基周圍的山峰（C）RMSF對應三高度活動外殘留（lyp24-asn25-asn26）不與CLR在向外擴展數據圖（循環互動8）；這些殘留物不能放置于電子密度。這三個殘基形成鉸鏈CGRP變化的CLR ECD的方向，特別是在RAM 1缺席；的RMSF價值更高，更高的末端，是戰略的疊加雙域性質的產品同時，CLR，但其相對值仍然有效。一些細胞外環的高活性是可見的視頻（補充視頻1-3）。
    
     分子動力學模擬中ram P1與CLR之間的氫鍵(6.4μs)。基于彩虹顏色標記將總持久性繪制到實驗結構，其中不涉及深藍色殘基和高紅色殘基。斜坡1顯示出精細的條帶，肽顯示出精細的白色帶。顯示了關鍵側鏈，但對于間歇氫鍵，旋轉體狀態被修改為顯示相互作用。相互作用網絡中的殘留物以相同的顏色標記。系統位于左側。在右上方，CLR跨膜結構域和ECD的上部擴大；在右下方，視圖在Z軸上旋轉90度。RAM P1-CLR相互作用、R112R-E47ECD和D113R-t288e Cl2/h289;/h289 ECL 2所涉及的氫鍵是顯著的。其它與穩定CLR和ram P1相互作用相關的氫鍵包括S107R-e47 ECD、R102R-D55ECD、H97R-q50 ECD、D90R-y49 ECD、D71R-r38ed和E29R-r119 ECD。表2.B顯示了模擬過程中ram P1和CLR之間的接觸（6.4s）。在實驗結構中，殘留側鏈的總持久性以青栗標度繪制，其中青栗殘基和高栗殘基從未涉及。otted線）被描繪成薄帶，而受體（實線）被描繪成厚帶和透明表面。系統的整體拓撲在左側。在右上方，最持久的相互作用包括RAMP殘基和CLR ECD、W59R、I63R、Y66R、H97R和I106R help錨定αH3和αH2的C端RAMP 1區域(CLR ECD殘基m42、T43 ECD、y46 ECD、y49 ECD、Q50 ECD和M53 ECD)。在右下角，ram P1與CLR跨膜結構域(即I123R、P126R、T130R、T134R和V137R)之間最持久的疏水相互作用(plus S141R)幫助將斜率跨膜螺旋錨定到CLR(TM3-TM5；CLR殘基y277 ecl2、H289 ecl2、A3005.45、I2353.52、F2624.52、L2584.48和W2544.44)。
    
     首先，兒童發育丙氨酸突變。CR核心丙氨酸突變，突變殘留物呈X -棒形式，突變殘基對信號無影響，CGRP信號12, 23, 28、30, 31, 32、34, 37, 38的殘留物也有明顯變化，在透明中也有突出顯示。CPK表示，并根據效果大小著色。黃色，90%關；暗橙，10-100次；紅色，100-1000次；黑色，1000次。CR和RAMP的主干（實線）以透明的灰白色帶顯示。CGRP肽（虛線）在X -S中表達。滴答格式，碳原子為暗紅色，極性原子為紅色或藍色。
    
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