石景山光學(xué)顯微鏡使用人CGRP受體活性GS蛋白復(fù)合物的低
作者: 發(fā)布時(shí)間:2022-07-02 17:30:08點(diǎn)擊:1739
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降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)是一種廣泛表達(dá)的神經(jīng)肽,在感覺神經(jīng)傳遞中起重要作用。CGRP受體是降鈣素受體樣受體(CLR)B類蛋白偶聯(lián)受體和1型跨膜結(jié)構(gòu)域蛋白受體M的異源二聚體。可溶蛋白1(RAMP1)。在此,我們報(bào)道了人CGRP受體復(fù)合物與CGRP和GS蛋白等三聚體的結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)通過低溫電子顯微鏡測(cè)定,具有3.3的全局分辨率,受體修飾蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域位于CLR跨膜區(qū)3, 4和5之間的界面上,并穩(wěn)定CLR的胞外環(huán)2。僅與CGRP直接接觸,這與CLR變構(gòu)調(diào)節(jié)中的功能一致。分子動(dòng)力學(xué)模擬表明RAMP1為受體復(fù)合物提供了穩(wěn)定性,特別是在CLR胞外域的定位中。控制G蛋白偶聯(lián)受體的功能。
所有相關(guān)數(shù)據(jù)可從作者處獲得,或包含在手稿或補(bǔ)充信息中。原子坐標(biāo)和冷凍-電磁密度圖已存儲(chǔ)在編號(hào)6e3y的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫和帶有條目EMD-8978的電子顯微鏡數(shù)據(jù)庫中。
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這項(xiàng)工作得到了莫納什大學(xué)拉馬喬蒂低溫電子顯微鏡中心、澳大利亞衛(wèi)生與醫(yī)學(xué)研究委員會(huì)(NHMRC)項(xiàng)目(1120919)和NHMRC項(xiàng)目(1055134)的資助。戴德華是NHMRC職業(yè)發(fā)展研究員,陳凱是NHMRCJ馬丁公司的研究員。詹姆斯·庫克研究員是馬斯登基金會(huì)的研究員,這兩人都是新西蘭皇家學(xué)會(huì)資助的。中華民國是皇家學(xué)會(huì)會(huì)員,感謝BBSRC(BB/M06833/ 1)的支持。烏洛斯和朱麗塔為其分析和技術(shù)支持,古德拉特為來自活動(dòng)CTR的CLR初步同源建模,弗內(nèi)斯、趙平和高爾為其有益的討論。
友一公司從事病毒生產(chǎn)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)、純化、負(fù)染電子顯微鏡、數(shù)據(jù)收集和分析、冷凍電子顯微鏡樣品的制備,負(fù)責(zé)模型的建立和改進(jìn),并協(xié)助手稿的制備。進(jìn)行冷凍樣品制備、相板成像、數(shù)據(jù)采集、電鏡數(shù)據(jù)處理與分析,計(jì)算冷凍EM圖,輔助原稿制作。博士生分子動(dòng)力學(xué)模擬,協(xié)助原稿制作。科技部協(xié)助建立和改進(jìn)模型,審稿,根據(jù)細(xì)胞分析和數(shù)據(jù)分析,審稿,對(duì)MRI手稿進(jìn)行了初步分析。約翰遜博士和世界銀行組織并管理了電壓階段開發(fā)項(xiàng)目。博士提供對(duì)CGRP受體的洞察力,協(xié)助數(shù)據(jù)解釋和手稿審閱。摩根士丹利提供對(duì)B類GPCR的洞察力,協(xié)助數(shù)據(jù)i解讀和審查手稿。在數(shù)據(jù)解釋和手稿準(zhǔn)備方面交換協(xié)助。中央情報(bào)局設(shè)計(jì)了分子動(dòng)力學(xué)模擬以協(xié)助數(shù)據(jù)解釋和幫助撰寫手稿。鄧文迪負(fù)責(zé)總體項(xiàng)目戰(zhàn)略和管理、數(shù)據(jù)。分析和解釋并協(xié)助撰寫手稿。下午3點(diǎn),負(fù)責(zé)總體戰(zhàn)略和管理,數(shù)據(jù)解釋和手稿寫作。
對(duì)這些序列進(jìn)行注釋以指示血凝素(HA)信號(hào)序列(紅色高亮)、3C切割位點(diǎn)(灰色高亮)、標(biāo)記(深橄欖綠色高亮)和希斯標(biāo)記(紫色高亮)的位置。CLR和ram P1的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域以綠色框架顯示并突出顯示。EM圖譜中未分析的蛋白片段以黃色突出顯示。側(cè)鏈密度有限但主鏈密度有限的氨基酸S在模型中被剔除,在序列中顯示為紅色。
A.未標(biāo)記CLR-ram P1(野生型(WT)CLR-ram P1)和純化的構(gòu)建(HA-Flag-CLR and Flag-ram P1)的藥理學(xué),CGRP介導(dǎo)的cAMP在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞中的積累。N=5個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn),重復(fù)3次;數(shù)據(jù)均值+標(biāo)準(zhǔn)偏差B,表達(dá)和純化。策略:從色譜洗脫曲線中排除C和絡(luò)合物的最終尺寸。D、SDS—PAGE和考馬斯藍(lán)染色顯示絡(luò)合物中各組分的存在。
伏相板復(fù)合體的顯微照片(代表3180膠片)。高對(duì)比度的相板成像有助于穩(wěn)健的顆粒選擇,雖然顆粒是低聚焦和緊密堆積的。B,重新發(fā)布2D類平均結(jié)果。C,映射細(xì)化工作流程。d銳化,計(jì)算RELION.E,金標(biāo)準(zhǔn)傅立葉殼相關(guān)曲線,總標(biāo)稱分辨率為3.26.F。過擬合通過將所有原子隨機(jī)移動(dòng)到0.5來評(píng)估,并根據(jù)低溫EM半圖進(jìn)行細(xì)化。在得到的模型和用于稀釋的半圖(綠色)、生成的模型和用于交叉驗(yàn)證的另一半圖(紅色)、以及最終的稀釋模型和完整的圖(藍(lán)色)G之間,urve與CLR的TM4和TM2堿基的潛在脂質(zhì)相互作用。
顯示受體、CGRP肽(不包括map中未解析的lyp24-Asn25-Asn26序列)、斜坡跨膜結(jié)構(gòu)域和冷凍-EM密度圖,以及所有7個(gè)跨膜螺旋和每個(gè)斜坡ECD螺旋的H8的模型。采用PDB中R1 ECD的剛體擬合模型:4rw G12,還顯示Gαs-Ras結(jié)構(gòu)域的N-末端(αH1)和C-末端(αH5)α螺旋,上標(biāo)P表示降鈣素基因相關(guān)肽的殘留。
研究了CLR(藍(lán)帶)和ram P1(橙帶)的ECD骨架以及用X射線晶體學(xué)12(淺灰?guī)?求解的分離的CLR-ram P1 ECD復(fù)合物的結(jié)構(gòu),在ram P1 ECD上對(duì)準(zhǔn)了結(jié)構(gòu),對(duì)CLR環(huán)(環(huán)1-5)進(jìn)行了注釋,得到了CLR環(huán)1和環(huán)的序列。5在低溫EM圖中未被解析,用黑點(diǎn)箭頭表示,CLR環(huán)4和5的主鏈位置的差異用藍(lán)色(活性復(fù)合物)和灰色(孤立ECD復(fù)合物)點(diǎn)箭頭表示,CGRP肽的位置用深紅色表示。
CLR-CGRP-ram P1-Galphaβ-Nb35(黑色,2.4us)、CLR-CGRP-ram P1-Galpha(371-394)紫色,2us)和CLL-CGRP-Galpha(371-394,藍(lán)色,2us)的模擬。C和CGRP(疊加在T6 S17上)對(duì)半數(shù)N個(gè)端子有效。一般來說,冰凍-電磁密度圖中缺失的片段對(duì)應(yīng)RMSF高的區(qū)域,ECD整體擬合的難度是交流電。ECD(D55ECD-V63ECD)和Q107ECD-g109 ECD的缺失片段對(duì)應(yīng)于最遠(yuǎn)離跨膜區(qū)的外環(huán)區(qū)。D55ECD-V63ECD顯示更大主干RMSF為8,而Q107ECD-g109 ECD顯示同樣高的RMSF為7.5。A79 ECD-g81 ECD和p115 ECD-s117 ECD附近的RMSF亞峰值稍低,但在跨膜區(qū)仍可分辨(a)ICL3(h324 ICL3-s328 ICL3)和EC。L3(p356 ec3-e362 EC3)都含有缺失的殘基,與RMSF高于4.5(B)。雖然CGRP與近端相互作用(無缺)區(qū)EC3,在這個(gè)區(qū)域有沒有持續(xù)的相互作用的分子動(dòng)力學(xué)模擬中,ICL的RMSF值(3.6)和ICL二(3)ARE高,造成茬(k1672.40)和e248 ICL ICL 2),但2 250骨架被分解,CGRP,26殘基周圍的山峰(C)RMSF對(duì)應(yīng)三高度活動(dòng)外殘留(lyp24-asn25-asn26)不與CLR在向外擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖(循環(huán)互動(dòng)8);這些殘留物不能放置于電子密度。這三個(gè)殘基形成鉸鏈CGRP變化的CLR ECD的方向,特別是在RAM 1缺席;的RMSF價(jià)值更高,更高的末端,是戰(zhàn)略的疊加雙域性質(zhì)的產(chǎn)品同時(shí),CLR,但其相對(duì)值仍然有效。一些細(xì)胞外環(huán)的高活性是可見的視頻(補(bǔ)充視頻1-3)。
分子動(dòng)力學(xué)模擬中ram P1與CLR之間的氫鍵(6.4μs)。基于彩虹顏色標(biāo)記將總持久性繪制到實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu),其中不涉及深藍(lán)色殘基和高紅色殘基。斜坡1顯示出精細(xì)的條帶,肽顯示出精細(xì)的白色帶。顯示了關(guān)鍵側(cè)鏈,但對(duì)于間歇?dú)滏I,旋轉(zhuǎn)體狀態(tài)被修改為顯示相互作用。相互作用網(wǎng)絡(luò)中的殘留物以相同的顏色標(biāo)記。系統(tǒng)位于左側(cè)。在右上方,CLR跨膜結(jié)構(gòu)域和ECD的上部擴(kuò)大;在右下方,視圖在Z軸上旋轉(zhuǎn)90度。RAM P1-CLR相互作用、R112R-E47ECD和D113R-t288e Cl2/h289;/h289 ECL 2所涉及的氫鍵是顯著的。其它與穩(wěn)定CLR和ram P1相互作用相關(guān)的氫鍵包括S107R-e47 ECD、R102R-D55ECD、H97R-q50 ECD、D90R-y49 ECD、D71R-r38ed和E29R-r119 ECD。表2.B顯示了模擬過程中ram P1和CLR之間的接觸(6.4s)。在實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)中,殘留側(cè)鏈的總持久性以青栗標(biāo)度繪制,其中青栗殘基和高栗殘基從未涉及。otted線)被描繪成薄帶,而受體(實(shí)線)被描繪成厚帶和透明表面。系統(tǒng)的整體拓?fù)湓谧髠?cè)。在右上方,最持久的相互作用包括RAMP殘基和CLR ECD、W59R、I63R、Y66R、H97R和I106R help錨定αH3和αH2的C端RAMP 1區(qū)域(CLR ECD殘基m42、T43 ECD、y46 ECD、y49 ECD、Q50 ECD和M53 ECD)。在右下角,ram P1與CLR跨膜結(jié)構(gòu)域(即I123R、P126R、T130R、T134R和V137R)之間最持久的疏水相互作用(plus S141R)幫助將斜率跨膜螺旋錨定到CLR(TM3-TM5;CLR殘基y277 ecl2、H289 ecl2、A3005.45、I2353.52、F2624.52、L2584.48和W2544.44)。
首先,兒童發(fā)育丙氨酸突變。CR核心丙氨酸突變,突變殘留物呈X -棒形式,突變殘基對(duì)信號(hào)無影響,CGRP信號(hào)12, 23, 28、30, 31, 32、34, 37, 38的殘留物也有明顯變化,在透明中也有突出顯示。CPK表示,并根據(jù)效果大小著色。黃色,90%關(guān);暗橙,10-100次;紅色,100-1000次;黑色,1000次。CR和RAMP的主干(實(shí)線)以透明的灰白色帶顯示。CGRP肽(虛線)在X -S中表達(dá)。滴答格式,碳原子為暗紅色,極性原子為紅色或藍(lán)色。
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